1. 如果继续使用缓冲液,则建议将 10X 缓冲液保存在 4°C 下 1-2 周。如要保存更长时间,则缓冲液应保存在 -20°C 下。如果要进行数次实验,则建议分装 10X 缓冲液。
2. 在 24-30°C 下解冻 10x 缓冲液,上下颠倒混合。
3. 用 ddH2O 将 10X RIPA Buffer 稀释为 1X 溶液。该产品提供的 10X 材料足以制备 150ml 总细胞提取物。
4. 将 1X 缓冲液放在冰上冷冻,并在使用前立即添加 PMSF。
注意:CST 建议使用前立即添加 1 mM PMSF。
裂解:
如需裂解黏附细胞,我们建议以下步骤:(所有试剂和裂解物必须冷藏)。
1. 按需处理细胞。
2. 平板用 PBS 洗涤,以去除残留的培养基。
3. 每个 10 cm 的培养皿添加 400 µl 1x RIPA 缓冲液。
4. 平板放在冰上孵育 5 分钟。
5. 刮取细胞。
6. 超声短暂处理。
7. 提取物用冷微量离心机以 14,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟。
8. 取上清液后使用。
其他注意事项:
1. 对于非黏附细胞,用 1X PBS 洗涤并进行沉淀后,每 107 个细胞添加 400 µl 缓冲液。
2. 1X RIPA Buffer 可用于裂解组织样品,尽管在添加裂解缓冲液后建议进入均化步骤。按照 100 mg 组织对应 1 ml 缓冲液的比例提取组织。组织提取物还需进行超声处理。
3. 其他蛋白酶抑制剂可添加到 1x 裂解缓冲液中。
4. 试剂抵达时,该缓冲液中可能会发生聚沉,因为提供的 10X 配制液中包含高浓度的试剂。有时,即便加热到室温,也会持续聚沉。我们建议将缓冲液加热到 37°C 15 分钟后混合,以消除沉淀。或用 ddH2O 将 10X RIPA 稀释为至少 5X 的溶液,以便获得不含沉淀物的溶液。一旦稀释,可进行分装并保存在 -20°C 下供日后使用。