RIPA Buffer (10X)

1. 如果继续使用缓冲液，则建议将 10X 缓冲液保存在 4°C 下 1-2 周。如要保存更长时间，则缓冲液应保存在 -20°C 下。如果要进行数次实验，则建议分装 10X 缓冲液。

2. 在 24-30°C 下解冻 10x 缓冲液，上下颠倒混合。

3. 用 ddH2O 将 10X RIPA Buffer 稀释为 1X 溶液。该产品提供的 10X 材料足以制备 150ml 总细胞提取物。

4. 将 1X 缓冲液放在冰上冷冻，并在使用前立即添加 PMSF。

注意：CST 建议使用前立即添加 1 mM PMSF。

裂解：

如需裂解黏附细胞，我们建议以下步骤：（所有试剂和裂解物必须冷藏）。

1. 按需处理细胞。

2. 平板用 PBS 洗涤，以去除残留的培养基。

3. 每个 10 cm 的培养皿添加 400 µl 1x RIPA 缓冲液。

4. 平板放在冰上孵育 5 分钟。

5. 刮取细胞。

6. 超声短暂处理。

7. 提取物用冷微量离心机以 14,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟。

8. 取上清液后使用。

其他注意事项：

1. 对于非黏附细胞，用 1X PBS 洗涤并进行沉淀后，每 10⁷ 个细胞添加 400 µl 缓冲液。

2. 1X RIPA Buffer 可用于裂解组织样品，尽管在添加裂解缓冲液后建议进入均化步骤。按照 100 mg 组织对应 1 ml 缓冲液的比例提取组织。组织提取物还需进行超声处理。

3. 其他蛋白酶抑制剂可添加到 1x 裂解缓冲液中。

4. 试剂抵达时，该缓冲液中可能会发生聚沉，因为提供的 10X 配制液中包含高浓度的试剂。有时，即便加热到室温，也会持续聚沉。我们建议将缓冲液加热到 37°C 15 分钟后混合，以消除沉淀。或用 ddH2O 将 10X RIPA 稀释为至少 5X 的溶液，以便获得不含沉淀物的溶液。一旦稀释，可进行分装并保存在 -20°C 下供日后使用。