浅谈原代细胞培养那点事儿

一、何谓原代培养？

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞，或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。

原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和螯合剂（常用EDTA）处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。

二、原代培养的方法

•组织块培养法：在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐缓冲液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。是常用的、简便易行和成功率较高的方法。

•酶消化法：将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。

•悬浮细胞培养法：对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。   
•器官培养：从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。 

三、前期准备及器材处理

1.前期准备

在您带上手套开始细胞培养之前,先检查一下移液管和瓶子的数量是否充足,以免在开始实验后再次出入操作台.

这样可以降低细胞污染的风险.

细胞培养基也应先预热,选择只预热部分培养基而非整瓶加热,不但可以节约实验时间,而且可以避免因反复加热培养基而造成的蛋白质降解.

结束操作后,别忘了培养基对光敏感,应尽可能避光保存.

2.生物安全柜的消毒及布局

保持安全柜内的整洁有序，将所有物品置于直视范围内。

向放入安全柜内的所有物品喷洒70%乙醇，擦拭清洁进行消毒。

在安全柜中部开阔处放置细胞培养容器；移液器置于右前方易于取用；试剂和培养基置于右后方便于吸取；试管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放废液。

3.培养瓶/皿等物品的无菌操作

无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等物品使用时方可揭开盖子，不得将其开放暴露于环境中，操作完成后尽快盖上盖子，取下盖子时应将盖子开口朝下放在工作台面上。

进行无菌操作时不要说话、唱歌或吹口哨。尽快完成实验，以尽量避免污染。

四、原代细胞培养流程（例：乳鼠肺组织）

1.取材：将1-3天新生乳鼠尾巴提起，整个身体浸入装有75%酒精的烧杯中3秒左右（默数5下），取出放置到灭菌的培养皿中，移入工作台内。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上，大头针分别固定头、尾和四肢。用碘酒、75%酒精消毒胸廓部位皮肤。在胸廓正中线中位处，用两把眼科弯镊夹起皮肤（多夹些），向左右两侧撕拉，膈肌部位皮肤向尾端拉，皮肤外翻固定，躯干部肌肉暴露（注意：不要使表皮面接触到已暴露出来的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，沿着隔膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断。胸廓暴露后，可见跳动的心脏和粉红色的肺。将眼科镊弯头端向下，从心脏右上方位插入心肺连接处，轻轻向上用力，将心肺一起取出，用镊子去除心脏，肺移入已加Hanks也的青霉素瓶内。

2.漂洗：用Hanks液漂洗肺脏表面血污，然后粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次后，吸去多余液体。

3.剪切：组织小块置青霉素瓶一角，用眼科直剪反复剪切组织块成1立方毫米大小，此过程需20~30分钟。

4.消化：消化条件的选择和组织块大小、组织的硬度、消化酶浓度和种类、实验温度、pH值等有关。消化酶浓度范围为0.25%~0.5%，pH为7.4~8.0，所使用消化液量是被消化物的5~10倍。可通过预实验，确定最佳消化条件。

5.制备单细胞悬液

•离心管的外壁和管口处经酒精消毒，然后移入超净台内，管口火焰消毒，Hanks液加至10ml(稀释酶浓度，停止消化）

•用吸管头反复轻轻吹打松散组织，当其能顺利地通过吸管口时，消化较合适，悬液中有较多分散的单细胞和小细胞团。

•离心管直立静置片刻，少量未消化的组织块自然沉降（可加消化液再消化）。将细胞混悬液移至离心管中，补加Hanks液至10ml，混匀后离心（速度、时间同上）。

科研中常用筛网法去除细胞混悬液中的细胞团，收集过筛网的单细胞悬液。

•去上清液后加2ml细胞培养液，细胞混匀计数，调整细胞浓度为5.0×105/ml。

6.接种：在培养瓶的侧面做好标记，培养物的名称、组号和日期。接种时，在25ml培养瓶中先加入1.5ml培养液，再接种1ml细胞悬液，用吸管轻轻混匀细胞后加盖瓶塞。持瓶作上下、左右十字形水平晃动后，移入37℃、5%CO2培养箱中培养。

五、原代细胞操作要领

1.原代细胞混匀操作要领

•火焰消毒吸管，用Hanks液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。

•吸管头插入管底。

•用吸管反复轻轻吹打组织块。

2.器械的使用操作要领

•用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械

•器械置无菌干纱布内擦一下，迅速通过火焰，冷却后使用

•用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒

•器械按浸泡消毒的顺序使用

•各套再消毒器械不可混用

3.除去组织块多余水分的操作要领

用吸管将组织块推向青霉素瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余水分。

注意：多余水分若不除去，会使组织块剪切不细，消化后的细胞悬液清亮（细胞数少），并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。

4.细胞计数操作要领

•用吸管混匀待计数的细胞悬液

•将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交接部位滴入细胞计数池中

•沉降1分钟，低倍镜下计数血球计数板四大中格中的结构完整的细胞，小细胞团计数为1

•计数时，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。

（四大中格细胞数/4）×10000=细胞数/毫升

注：细胞计数板上，每一中格体积为0.1立方毫米

六、原代培养注意事项

•细胞生长密度不高时，不能急于传代培养

•原代培养的贴壁细胞需控制消化时间

•吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形

成，以尽可能减少对细胞的机械损伤

•首次传代细胞接种数量应多一点，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬

液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。

•首次传代细胞培养pH偏低些

•胎牛血清浓度可加大至15%-20%

•加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来

七、如何提高原代细胞培养的成功率？

•在选择材料的时候一定要注意选取比较健康的小鼠。在处理胚胎的时候要干净利落。不要把胳膊等部位的细胞混进去了。

•操作一定要无菌，不能污染。在剪碎细胞的时候，一定要注意尽量剪得碎一点。

•运用消化法时胰酶温度应小于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。

•如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。

•取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。

八、原代细胞培养的胎牛血清推荐

根据我们销售团队的经验及全国高校老师的反馈结果，Noverse进口血源优级胎牛血清或Noverse澳洲优级胎牛血清均适合不同细胞的原代培养。不过还可能考虑到您的实验室环境、操作人员的操作水平等等，最终来确定您要选择哪种等级的胎牛血清。